酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种常见的生物化学工具,用于检测液体样品中的特定配体。 基本原理涉及将配体固定在96孔聚苯乙烯板上,并随后使用抗体进行检测。 我们已经与Rockland Immunochemicals,Expedeon,Boster Bio和RayBiotech的专家进行了交谈,以了解有关四种最常见ELISA类型的更多信息。

直接检测ELISA

ELISA策略最简单的变化就是直接检测。 对于此方法,您首先将含有目标抗原的样品倒在板上,然后使其非特异性地附着在表面上。 接下来,放入与检测酶(例如HRP或AP)偶联的抗体,使其结合抗原。 最后,添加酶底物,该酶底物产生比色信号。 该信号揭示了哪些孔含有酶,因此也含有目标抗原。

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“直接ELISA的优点是速度最快,因为它只涉及一种抗体,避免了二抗的交叉反应问题,”质量控制经理Georgia Sfyroera博士和Yu-Hung Huang说,罗克兰免疫化学公司(Rockland Immunochemicals)博士,研发高级科学家。

但是,当然,每个优点都有缺点。 Expedeon产品经理Isabella Pupita说:“与间接ELISA相比,直接ELISA具有更高的背景,并且由于不使用二抗,它们的敏感性较低。”

Sfyroera和Huang认为,直接检测方法“广泛应用于纯目标物的滴定”,因为高纯度的样品能够直接包被聚苯乙烯板,而不会阻碍其他抗原。 Pupita补充说,该策略还可以用于验证样品中抗体的存在,并且通常用于诊断感染和过敏。

间接检测ELISA

间接检测的开始方式与直接检测相同。 您将包含目标抗原的样品倒在板上,然后添加一抗。 区别在于,在这种情况下,一抗是未标记的。 相反,您添加了标记的二抗。 最后,添加酶底物,显示哪些孔包含目标抗原。

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一个以上的二级抗体可以与一个一级抗体结合。因此,在该策略中添加二抗可通过放大信号来提高测定的灵敏度。 Sfyroera和Huang解释说:“这确保了比传统的直接ELISA更好地检测到较低浓度的靶标。”

“此外,” Pupita补充说,“相同的二抗可以与不同的一抗一起使用,从而降低了成本并提高了灵活性。”

但是,就像直接分析一样,这些好处也需要权衡取舍。 Pupita说:“间接ELISA的一个很大的缺点是第二抗体对不同的第一抗体种类或内源蛋白质的交叉反应性,这会增加背景信号。” “使用二抗还需要更多的孵育和洗涤步骤,从而使测定更容易出错。”

一般而言,间接检测方法用于与直接检测相同类型的样品。 “直接检测ELISA更方便,而间接检测ELISA更灵敏,” Boster Bio营销副总裁夏思杰说。 “如果测定需要额外的灵敏度,则使用后者,否则,请使用前者。”

夹心ELISA

大多数可商购的ELISA试剂盒使用三明治ELISA策略,该策略使用两种不同的抗体来检测抗原,而不是一种。 在夹心ELISA中,您首先用捕获抗体包被聚苯乙烯板。 接下来,倒入样品,使目标抗原结合捕获抗体。 最后,添加另一种抗体并使其结合抗原。 检测方法可以是直接或间接的,具体取决于您是否使用二抗。

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Sfyroera和Huang说:“夹心ELISA可提供更高的特异性,因为需要一对抗体。” 因此,强烈建议在复杂样品中检测分子,例如血清,尿液,裂解物,上清液等。使用一对抗体可确保从其他蛋白质基质中捕获并检测靶标。 ”

“但是,” Pupita补充说,“抗体对(如果不易获得)可能需要优化以排除捕获抗体和检测抗体之间的交叉反应性。”

夹心测定的另一个缺点是它不仅仅适用于任何抗原。 Xia说:“夹心ELISA仅适用于可以被两种以上抗体结合的大分子。”

竞争ELISA

当抗原很小或表位有限时,竞争性检测是一种选择。 Pupita说:“竞争性ELISA具有最大的灵活性,因为它们可以适应上述任何一种测定形式。”

在一种基本的检测方法中,您用捕获抗体包被平板,然后添加(1)样品和(2)与检测酶偶联的纯化抗原。 纯化的抗原将与样品抗原竞争与捕获抗体的结合,这意味着信号越低,样品中的抗原浓度就越高。

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“竞争性ELISA可以直接测量多种浓度下生物分子的干扰程度,” Sfyrorea和Huang解释说。 “即使ELISA没有生物传感器实验的强大输出,它仍然提供了可用于更详细研究的信息。”

“此外,” Pupita补充说,“竞争性ELISA对样品稀释和基质效应较不敏感,并且在重复样本之间不易出现变异,从而使测定稳定可靠。”

夹心法和竞争性ELISA的替代方法是相对稀少的基于细胞的ELISA,该方法将预先测量的管家基因(例如GAPDH)的水平与细胞内的目标蛋白进行比较。 夏说:“请注意,基于细胞的格式不是定量的,只能用于定性测量,因为我们不知道基质中有多少管家基因蛋白。”

尽职调查

在购买之前,“请考虑试剂盒的敏感性,可重复性和准确性,” Sfyroera和Huang建议。 “仔细查看套件随附的质量控制数据将确保套件符合行业标准。”

不幸的是,这是一个真正的问题。 一些信誉不佳的公司掠夺了急于寻找适合他们的工具包的客户。

夏说:“有些公司声称对蛋白质组中的几乎所有东西都有成千上万的ELISA试剂盒。” “然后,他们出售这些ELISA试剂盒,声称可以检测分析物,但实际上检测的是TGF-beta之类的东西。”

学术文献已经报道了这种情况,但夏认为这些文章还没有得到足够的报道。 这是一份报告假阳性ELISA试剂盒的示列。