ELISA常见问题解答     DATE: 2019-11-11 17:45

ELISA试剂盒被列为“定制”是什么意思?

RayBiotech具有庞大的阵列验证抗体三明治对文库,但是并不是所有的抗体三明治对都以96孔板ELISA格式开发。 因此,列为“定制”的ELISA试剂盒需要5-7周的开发阶段,RayBiotech在收到该试剂盒的订单后即开始。 开发只需进行一次,之后最终试剂盒将通过RayBiotech的ELISA 质量控制测试 此时,该套件将添加到我们的库存套件清单中。


一个RayBio ELISA可以测试多少个样品?

在每个96孔板上,用一式两份孔绘制一条8点标准曲线。 然后将其余的孔用于样品(强烈建议重复两次)。 如果将整个平板用于1个实验,则剩余的80孔将一式两份地容纳40个样品  如果没有一次运行,则每次运行都必须包括一条新的标准曲线,从而将潜在样本的数量减少8(以考虑新的标准曲线点)。


您的ELISA试剂盒是否有阳性对照样品?

RayBio Sandwich ELISA试剂盒不含生物学参考样品。 重组标准品可作为阳性对照或可用于加标回收研究。


我的套件在室温下搁置了几天。还好吗?

该试剂盒在室温下放置较长时间后,其活性可能会降低,但很可能仍可以使用,尤其是如果只保留少量时间的话。 试剂盒中对温度最敏感的成分是标准品,HRP-链霉亲和素和检测抗体。


您的ELISA试剂盒验证过程是什么?

在RayBiotech,我们非常重视我们的产品质量。 我们生产的每个套件都经过一系列严格的产品特定质量控制测试,并按照GMP和ISO 13485标准制造。 我们的质量声明可以在这里查看。

重现性和精度

我们的夹心ELISA试剂盒通过将2-3个阳性对照样品一式两份在一个平板上一式两份进行测试(最大耐受度= 10%CV),从而评估了其批内分析的重复性。 使用2-3个阳性对照样品和完整的标准曲线(最大耐受度= 12%CV),通过至少2次独立实验评估测定间的可重复性。 通过比较2-3个阳性对照样品的计算浓度与当前批次和先前批次的校准曲线(最大容差= 20%CV)来测试批次间的一致性。

稀释线性和回收率

通过将各种水平的目标蛋白掺入生物样品中来确定回收率。 通过对生物样品进行2倍和4倍稀释来测试稀释线性。 回收率通常为80-130%(最大耐受度为70-150%)。 测试的生物样品类型包括血清,EDTA血浆,柠檬酸盐血浆,肝素血浆(正常健康供体)和细胞培养基(DMEM或1640)。 血清和血浆的推荐稀释范围由该测试系列确定。 对于裂解物特异性夹心ELISA(目录号以“ -CL”结尾),样品类型包括各种来源的细胞裂解物和组织匀浆。


您的ELISA试剂盒可用于细胞和组织裂解液吗?

目录号以“ -CL”结尾的ELISA试剂盒经过优化和验证,可用于细胞和组织裂解液样品。 RayBiotech尚未通过细胞或组织裂解液验证所有其他ELISA和EIA试剂盒(产品目录号不含“ -CL”),但是RayBio试剂盒通常可以容纳许多不同的样品类型。 所有RayBio磷酸化ELISA试剂盒均已通过细胞裂解液验证。

测试裂解液样品时,RayBiotech建议使用方案中指定的适当稀释缓冲液将样品稀释至少5倍。 这种稀释可最大程度地减少裂解缓冲液中存在的去污剂引起的干扰。 推荐的裂解物总蛋白浓度至少为1 mg / ml。 然后应将原始裂解物稀释(优选5倍或更多倍)至50-500 µg / ml的工作浓度范围。 请注意,这些浓度范围代表一个起点,研究人员可能需要进一步优化。

RayBiotech带有裂解缓冲液(目录号EL-Lysis),可以单独购买。 如果研究人员喜欢准备自己的裂解缓冲液,则应查看此链接上所述的指导原则:

样品制备技巧

简而言之,用于RayBio ELISA的裂解缓冲液必须符合以下规格:

  • 盐含量相对较低(700 mM或更小)
  • 不含叠氮化钠
  • 不含> 0.1%SDS或其他强变性表面活性剂
  • 不含> 10 mM的还原剂(β-巯基乙醇或二硫苏糖醇)

针对免疫沉淀优化的缓冲液(例如RIPA缓冲液 )通常符合这些规格。


您为我的样品推荐哪种稀释度?
  • 血清和血浆(基于正常健康的供体)-推荐的稀释范围在产品手册的第V节(试剂制备)中指明。
  • 条件培养基-分析物的水平完全取决于实验条件,因此必须凭经验确定最佳稀释因子。 但是,一般而言,我们建议从不稀释或以1:2稀释的条件培养基开始。
  • 裂解物-我们建议5倍或更大,以确保裂解缓冲液去污剂的干扰最小。
  • 其他体液(唾液,CSF,尿液,眼泪,BAL液,牛奶等)-最佳稀释范围差异很大,应由研究者确定。

如果您不确定从何处开始,技术支持团队可以帮助您找到引用RayBio试剂盒且其样品类型与您相似的出版物。


标准曲线信号弱

如果您的标准曲线OD信号很低(最高标准<0.7),请考虑以下提示和最佳做法:

  • 在打开前,将检测抗体和标准品的小瓶短暂离心至关重要,因为粉末或浓缩液会聚集在瓶盖内。
  • 用Assay Diluent稀释标准液后,可通过上下吸液或交替翻转和轻拂小瓶几次来轻轻混合液体。 然后应将小瓶短暂离心以收集试管底部的液体。 通常不建议涡旋。
  • 检测抗体或HRP-链霉亲和素稀释不正确也可能导致信号弱。 仔细检查这些试剂的制备,因为即使略有变化也会产生明显的信号差异。
  • 使用比手册中建议的时间短的孵育时间可能会导致信号降低。 相反,将标准液在4°C下孵育过夜可以增强微孔板上的整体信号。
  • 将Stop Solution添加到每个孔后,应立即在450 nm处读取OD。 颜色快速褪色,导致OD降低。

在对低OD值进行故障排除时,RayBiotech建议准备一份新鲜的标准液(每个试剂盒都带有一个额外的C瓶),并使用上述提示进行重新测试。


低总信号

总体信号较低是由检测过程中的问题引起的,即检测抗体,HRP-链霉亲和素或TMB一步底物)。 请考虑以下提示和最佳做法:

  • 检测抗体–重组前一定要离心。 一旦重新配制,该试剂必须在一两天内使用。 每个小瓶都包含足够用于平板一半(48孔)的抗体。 每个套件中提供了两个试管。
  • HRP-链霉亲和素–该试剂为液体浓缩物。 从试管中抽出任何液体之前,请确保将小瓶离心并上下吸打以充分混合,因为在储存过程中可能会形成沉淀。
  • 稀释后,必须在同一天使用HRP-链霉亲和素溶液。 丢弃未使用的部分。
  • 切勿使用测定稀释剂A稀释HRP-链霉亲和素。该稀释剂含有叠氮化钠,后者是HRP活性的抑制剂。
  • TMB一步式底物-该成分在4°C下可稳定6个月,但必须避免光照。
  • 预涂的微孔板–打开防潮袋后,任何未使用的微孔板条必须在4°C下保存并在1个月内使用。 将未使用的胶条放回装有干燥剂包装袋的袋子中,然后沿整个边缘重新密封袋子。
  • 遵守试剂盒的存储准则(4˚C存放6个月或-20˚C存放1年)。 避免多次冻融循环。

高背景

高背景的常见原因包括:

  • 过多的HRP-链霉亲和素会导致高背景。 为了确保HRP-链霉亲和素的正确浓度,在使用之前,先将(项目G)的小瓶离心,然后上下吸打以轻轻混合,然后再使用,以溶解储存期间可能形成的沉淀物。
  • 太多的检测抗体也可能导致高背景。 确保使用正确稀释的生物素化抗体。
  • 样品和标准品的温育时间长会导致高背景。 请遵守手册中建议的孵育时间。
  • 如果未充分洗涤板或洗涤缓冲液被污染,可能会引入高背景。 每次清洗后,必须从孔中完全除去清洗缓冲液。 为了获得最佳效果,建议使用自动洗板机或多通道移液器。 切勿使用洗涤瓶将洗涤缓冲液充满孔中。

矩阵效果

基质效应是非线性稀释反应的常见原因。 当样品中的蛋白质或其他成分影响靶分子的免疫反应性时,可能会发生这种情况。 这些基质成分也会影响抗体识别样品中靶标的能力。 自身抗体,结合蛋白,溶血或某些疾病状态(例如高脂血症样品)可能导致这种现象。 如果怀疑基质效应,则将样品离心并进一步稀释。 在测试血清或血浆时,始终建议至少稀释2倍以避免基质效应。


复制孔的CV高

井间变异性高的常见原因包括:

  • 移液器性能–确保移液器已校准且功能正常
  • 井中有气泡
  • 不完全清洗–确保每次清洗后完全除去清洗缓冲液。
  • 使用洗涤瓶洗涤孔–建议使用移液器或洗板机。
  • 试剂混合不完全(尤其是检测抗体)。


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